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南京森贝伽实验方法学(2)
人阅读 发布时间：2017-01-13 16:54
南京森贝伽实验方法学(2)
新年将近，南京森贝伽产品火热促销，价格优惠，质量保证，产品买的多折扣就多，另有礼品赠送。我司主营现货产品有ELISA试剂盒、细胞株、抗体、标准品、血清、培养基、染色液等，欢迎来电订购！本公司产品仅用于科研使用，不供临床实验。五、培养细胞的前处理：
1、培养液的测定：
直接吸取培养液，2500转/分，离心10分钟，取上清液进行测定。
[注]：一般建议细胞密度在100万个/ml以上。
2、培养细胞的测定：
①、细胞沉淀的收集：
对于悬浮培养的细胞，通过离心收集细胞沉淀，将细胞悬液1000转/分，离心10分钟，弃上清留细胞沉淀；对于贴壁培养的细胞，用胰酶将细胞消化下来加入培养基终止消化，或用细胞刮将细胞刮下来；制成细胞悬液，1000转/分，离心10分钟，弃上清留细胞沉淀。
[注]：一般建议收集的细胞数量在100万个以上。
②、细胞沉淀的洗涤：
在细胞沉淀中加入0.5～1ml的等渗缓冲液（推荐0.1mol/LpH7～7.4磷酸盐缓冲液或生理盐水），轻轻颠倒混匀，1000转/分，离心10分钟，弃上清留细胞沉淀，重复洗涤2～3次。
③、细胞匀浆液的制备：
在细胞沉淀中加入一定量的等渗缓冲液（等渗缓冲液的加入量根据所测指标的不同而有所改变，一般推荐加入0.5ml，细胞密度不小于100个/ml），混匀，将细胞悬浮于等渗缓冲液中。
[注]：等渗缓冲液推荐使用0.1mol/LpH7～7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）或生理盐水（0.86%或0.9%）。
手动匀浆：用移液器将细胞悬浮液转移至玻璃匀浆管中（2ml玻璃匀浆管），将玻璃匀浆管置于冰水浴条件，手动匀浆，1分钟/次，间隔30秒，重复6～8次，然后取破碎好的匀浆液进行测定（不离心）。
超声破碎：将细胞悬液置于冰水浴条下，超声破碎：功率300W，3～5秒/次，间隔30秒，重复3～5次；取破碎好的匀浆液进行测定（不离心）。
[注]：细胞破碎好以后取出部分匀浆液显微镜观察，如细胞还未破则增加重复次数；测定相应指标的同时需测一下相应样本的蛋白浓度，总蛋白测试盒本所有售。
因为很多裂解液都是蛋白变性剂，因此如果老师测定的指标是酶相关的，一般不建议用裂
解液来裂解细胞。
3、培养液及细胞一起处理后测定：
对于悬浮培养的细胞直接进行破碎；对于贴壁细胞用细胞刮直接将细胞刮下来，制成细胞悬液以后进行破碎
[注]：一般建议收集的细胞密度在100万个/ml以上。
手动匀浆：用移液器将细胞悬液转移至玻璃匀浆管中（2ml玻璃匀浆管），将玻璃匀浆管置于冰水浴条件，手动匀浆，30秒/次，间隔30秒，重复6～8次，然后取破碎好的匀浆液进行测定（不离心）。
超声破碎：将细胞悬液置于冰水浴条下，超声破碎：功率300W，3～5秒/次，间隔30秒，重复3～5次；取破碎好的匀浆液进行测定（不离心）。
[注]：细胞破碎好以后取出部分匀浆液显微镜观察，如细胞还未破则增加重复次数；测定相应指标的同时需测一下相应样本的蛋白浓度，总蛋白测试盒本所有售。
六、线粒体及微粒体的提取：
1、制备10%的组织匀浆（详见组织匀浆方式）
2、制备线粒体：取10%的组织匀浆，用普通离心机或低温低速离心机以1000～2000转/分,离心10分钟，弃沉淀，取上清液以8000～10000转/分（低温高速离心机）离心15分钟，沉淀物为线粒体。
3、胞浆部分：分离线粒体后的上清液即为胞浆。
4、制备微粒体：取分离线粒体后的上清液即胞浆，以144000g即40000转/分,离心30分钟，沉淀物为微粒体。
5、将分离的线粒体或微粒体分别用冰冷的匀浆介质制备成混悬液，用手工匀浆或机器匀浆使线粒体或微粒体破碎，或者用somiprep150型超声发生器以振幅14微米超声处理30秒，或者用国产超声波发生仪，400安培，5秒/次，间隙10秒反复3～5次，使线粒体或微粒体破碎，待测酶活力，也可用反复冻融的方法使其破碎，但有部分酶活力会受影响。
6、制备好的线粒体、微粒体、胞浆部分可根据您的需要分别进行各种测定。
七、线粒体的鉴定（中性红－詹纳斯绿B染色）：
在两张干净载玻片中央各滴2～3滴中性红—詹纳斯绿B染液，待其中的酒精蒸发完全后，用牙签挑少许沉淀物均匀涂布在一张玻片的染液中；另取上清液一滴，混于另一张玻片的染液中，两片分别盖上盖玻片，染色5分钟，在高倍镜下观察，被染成亮绿色颗粒即线粒体。
中性红－詹纳斯绿B染色的配制：
A液：取詹纳斯绿B（Jana’sgreenB）饱和水溶液（溶解度5.18%）3滴滴入5ml无水乙醇中，混匀。
B液：取饱和中性红（Neu－tralred）水溶液（10mg中性红溶于150ml蒸馏水中，并用黑纸包好贮冰箱）20～30滴滴入5ml无水乙醇中，混匀；用时将A液和B液混和即成中性红－詹纳氏绿B染液（混和液中的染料不稳定会在24小时内发生沉淀）。
[注]：1、若发现涂片上有成团的染料可将詹纳氏绿B3滴改成1滴或2滴，而将中性红20～30滴改为10～20滴。
2、本研究所线粒体制备方法较为成熟，一般不需要染色鉴定。
八、红细胞中SOD的抽提：
1、采集手指血、或肝素抗凝的静脉血或动脉血50µl[注1]，冲入盛有1～2ml的生理盐水的带刻度离心管中,500～1000转/分,离心10分钟。
2、用微量移液器吸去上清液（要吸干净），留沉淀的红细胞。
3、加入预冷的双蒸水0.2ml，混匀（使红细胞溶解）。
4、加入95%乙醇0.1ml，振荡30秒。
5、加入三甲烷（绿仿）0.1ml置旋涡混匀器充分混匀（抽提）一分钟。
6、3500转/分离心8分钟。
此时液体分三层：上层为SOD抽提液，中层为血红蛋白沉淀物，下层为三甲烷。若上清有混浊可加入少量固体NaCl后再离心5分钟，即可澄清。；记录上清液体积，取5～20µl作SOD测定[注2]。
[注1]：大、小鼠可取内眦血，用玻璃毛细管从内眦部斜向咽喉方向刺入，或者剪尾取血，将血滴在含肝素并烤干的玻片上（烤干时温度要低于80℃），再用移液器取50µl血，作SOD抽提。血量少时可取10～20µl抗凝全血（做慢性动物试验，在饲养过程中可以反复取血5～6次）。
[注2]：哺乳动物红细胞中只有铜锌SOD，没有锰SOD。
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