细胞房又污染了？这些细节你注意了吗？（三）

细胞存放管理是细胞实验室的“安全阀”和“资源库”。一套科学、规范的细胞冻存与管理流程，不仅是为了保证细胞活力，更是为了防止污染对实验结果的灾难性影响。

细胞冻存不仅是为了长期保存，更是为了在关键时刻“叫回”高质量的细胞。一个好的冻存体系，必须同时兼顾细胞活力与无菌安全。今天就给大家介绍一下细胞冻存管理中设备管理以及污染预防！

1. 细胞状态：必须是对数生长期（细胞活力 > 90%），确保细胞分裂能力强。镜下观察形态正确，尽量将死细胞以及代谢黑点清洗干净。

2. 无菌环境：冻存前必须进行支原体检测。支原体虽然肉眼不可见，但对细胞的基因表达和代谢影响极大，且极难清除。

3. 冻存管：建议使用一次性预封冻存管或不锈钢冻存管，避免反复使用导致的交叉污染

图1 冻存管（图片来源网络）

4. 程序性降温盒：

程序性降温盒通常包含异丙醇作为热传导介质。使用时需确保异丙醇液位高于预设刻度线，通常是盒体容积的50%-70%。如果液位过低，可能导致冻存管底部直接接触金属支架，引发“芯吸”作用或局部干烧，损坏样品。异丙醇有挥发性。建议每使用5次或每一个周期（如每周使用几次）后更换一次，以确保降温性能。在使用前，建议将降温盒置于-80℃冰箱中预冷至少4小时，确保盒内温度与冰箱环境一致，避免放入时产生温度冲击。

图2 程序性降温盒（图片来源网络）

1. 细胞收集：离心收集细胞，去除旧的培养基。

2. 计数与调节：使用计数仪计数，调整细胞浓度至 1×10^6/mL（或根据细胞类型调整）。

3. 配置冻存液：90%培养基 + 10% DMSO（二甲基亚砜）是经典配方。DMSO是保护剂，能防止细胞在结冰时被刺破。

4. 混匀：细胞悬液与冻存液以1:1比例混合，缓慢加入DMSO以降低毒性。

5. 慢冻降温：使用程序降温盒（每分钟降温约1℃），先放至-20℃存放10-20分钟。切勿直接放入-80℃冰箱骤降，防止冰晶伤害细胞。

6. 最终存储：24h后，将冻存管转入液氮罐中保存

1. 液氮的温度极低，接触皮肤会导致冻伤。

• 防护手套：必须佩戴耐低温防护手套，避免皮肤直接接触液氮或容器内部。

• 通风：液氮罐必须放置在通风良好的室内。液氮蒸发后会占据空气中的氧气，导致缺氧窒息。绝对禁止在密闭空间内长期存放液氮罐。

• 避光防热：应存放在阴凉干燥处，严禁暴露在阳光直射或高温环境下，防止罐体过热导致压力升高。

2. 罐体检查与维护

• 定期检查：使用前后必须检查罐体外观是否有凹陷、裂痕或严重碰伤。检查真空层是否完好（外观是否结霜）。

• 内部清洁：罐内必须保持干净，无异物。对于生物样本罐，液氮残留可能导致样本交叉污染。

• 防止冻结：避免在容器盖上堆放物品，以防止密封面冻结或被物体压坏。

3. 充装与取用操作

• 首次使用预冷：新罐首次使用或长期停用后，充装液氮前应先注入少量液氮预冷罐体，以免热胀冷缩导致罐体受损。

• 缓慢充装：充装液氮时应缓慢进行，避免液氮剧烈沸腾飞溅。液位应控制在容器容量的95%以内，防止液氮浸入颈管导致溢出。

• 快速取用：取放冷冻物品时动作要轻柔、迅速，避免剧烈震动。取用时间尽量短，防止液氮蒸发过快导致罐体真空破坏。

• 禁止倾倒：严禁倾倒罐内液氮，必须使用专用的倾倒阀或提筒。

4. 存放与长期管理

• 垂直放置：液氮罐必须保持直立，严禁倾斜、倒置或堆叠，以防止液氮泄漏。

• 定期补充：对于长期存放的罐体，应定期补充液氮。一般建议液氮残量保持在总容量的1/3以上，以确保内部温度保持在低温状态。

• 防震运输：运输液氮罐时必须使用防震支架，保持罐体直立。严禁剧烈碰撞或跌落。

图3 液氮罐（图片来源网络）

细胞冻存不是简单的“冷藏”，它是科学实验的“保险箱”。只有掌握了正确的冻存技术并严防细菌/支原体等微生物的侵扰，才能确保实验数据的可靠性与可重复性。