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南京森贝伽生物科技有限公司品牌商
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试剂/耗材/技术服务
已认证品牌介绍
京森贝伽生物科技有限公司（NanJing SenBeiJia Biotechnology Co.,LTD.），是一家集研发、生产、销售为一体的高新技术企业，专注于生命科学和生物技术研究，产品涵盖分子生物学、蛋白质组学、免疫学、细胞生物学等研究和应用领域。公司总投资超过 2000 万元，并先后引进了自动化设备，组建了专业的研发技术团队。凭借着洁净化的生产车间、标准化的质量管理系统，为生产高质量的产品提供了有效保证。森贝伽生物自主研发的 ELISA 试剂盒，在国内众多重点实验室广泛使用，深受广大科研人员的好评，先后在权威杂志文章中被引用。
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Santa Cruz
抗体
已认证品牌介绍
SANTA CRUZ公司是全球最大的抗体生产厂商之一，目前公司提供二万余种研究用的第一抗体，几乎覆盖了目前生命科学研究的各个最新领域，其每种抗体又有多个克隆可以选择，还提供一些对应蛋白标准品及相关产品，如ABC试剂盒，各种标记二抗，Western试剂盒，蛋白分子量Marker，核抽提物等，为免疫学研究工作提供了极大的方便。
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IHC问题总结(二)
470 人阅读发布时间：2016-08-11 18:00
IHC问题总结(二)
南京森贝伽热卖产品之一，我司主营产品有ELISA试剂盒、细胞株、标准品、染色液、抗体等，仅用于科研使用，不供临床实验。我司免费提供售前、售中和售后的全方位技术服务，产品种类齐全，质量有保证，价格实惠，欢迎来电咨询！Q6：一抗从4度拿出后，为什么要进行37度复温？
1）一方面，防止切片从4度直接放入PBS易脱片；2）另一方面，使抗原抗体结合更稳定。一般不需要，但对表达较弱的抗原可能有用，4度和37度时分子运动方式不同，前者分子碰撞机率和运动速度小于后者，后者结合更快，但敏感性也提高了并易造成非特异染色。
Q7：切片染色后背景太深，如何区分特异性与非特异性着色？全片着色是指整个切片全都染上了颜色，着色的强度可深可浅，总之，分不清那些组织是阳性那些组织是阴性。出现这种现象的原因有：
1）抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的原因之一。解决办法是，每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度，既使是即用型的抗体也应如此，不能只简单的按说明书进行染色。2）抗体孵育时间过长或温度较高：解决办法是，严格执行操作规程，最好随身佩带报时表或报时钟，及时提醒，避免因遗忘而造成时间延长。现在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传统的1小时，而是30分钟，因此，要根据染色结果进行调整。3）DAB变质和显色时间太长：DAB最好现用现配，如有沉渣应进行过滤后再用。配制好的DAB不应存放时间太长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会游离出氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。DAB的显色最好在显微镜下监控，达到理想的染色程度时立即终止反应。不过当染色片太多时或用染色机时，这样做似乎不现实，但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控，避免显色时间过长。4）组织变干：修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。解决的办法是操作要认真仔细，采用DAKO笔或PAPPen在组织周围画圈，可以有效的避免液体流失，也能提高操作速度。5）切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长（大于24小时）：原因上不清楚，但现象存在。有的实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复，第二天加抗体进行免疫组化染色，如果将装有切片和修复液的容器放在4ºC冰箱过夜，对结果无明显影响，如果放在室温，特别是炎热的夏天，会出现背景着色，因此，不可存放时间太长。6）一抗变质、质量差的多克隆抗体：注意抗体的有效期，过期的抗体要麽不显色要麽背景着色。用新买的抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。
Q8：脱片产生的原因有哪些？
1）多聚赖氨酸玻片质量的问题。2）组织切的不好，切片机的问题例如比较老的旧的机器切的厚或者不均匀，或者切片者手法不好等。3）没烤好，时间短，温度不够之类。4）操作的时候甩的太猛了，有脱片嫌疑的片子最好不甩或轻轻甩，用卫生纸从边缘上慢慢吸水。5）修复的问题：抗原修复的时候高压时间过长了，或者放进100度的修复液时手法不好，咚的一声就丢进去了，这样超容易脱片。此外，用EDTA修复比柠檬酸容易脱片，但是你要用到EDTA的时候也没办法，只有从另外的问题上着手。6）一旦见到有组织漂起来操作就更加要谨慎，用PBS的时候尽量用泡的，不要冲。基本上把这些方面都注意到了，能改善的尽量改善，脱片可以减少很多。7）组织的问题，我用的组织癌症的很多，越是癌症组织有坏死之类越容易脱。
Q9：DAB显色后发现切片着色不均匀：如一片着色，一片不着色或染色浅？
1）切出的片子厚度本身可能就不一样，切出一片厚，一片薄，这样可能造成着色深浅不一。2）有可能是你显色液底物加到片子上后没有摇匀，造成局部底物浓度不一致，所以加完显色液后最好将片子来回左右晃动几下，使片子上所有区域的底物浓度一致。3）如果你的片子是中间的染色深，靠近边上的浅，那有可能是你蜡圈画的太小，显色液覆盖的面积不过大而产生了边缘效应。最外侧的组织片最好离显色液外缘0.5cm。
Q10：染色过强
1）抗体的浓度过高或抗体孵育时间过长降低抗体滴度（一般指浓缩性抗体）2）孵育温度过高，3）DAB显色时间过长或DAB浓度过高，显色时间不能超过5-10分钟，以显微镜下观察为准
Q11：非特异性背景染色
1）操作过程中冲洗不充分2）组织中含过氧化物酶未阻断，可再配置新鲜3%H2O2封闭，孵育时间延长3）组织中含内源性生物素，可用正常非免疫动物血清再封闭4）血清蛋白封闭不充分，可延长血清蛋白封闭时间
Q12：染色弱
1）抗体浓度过低，孵育时间过短，可提高抗体浓度，孵育时间不能少于60分钟
2）试剂超过有效使用期及时更换试剂
3）操作中，滴加试剂时缓冲液未沥干，致使试剂稀释，可每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液（但防止切片干燥）
4）室温太低，低于15℃若室温低于15度，要改放在37℃孵育箱孵育30-60分钟（或4℃冰箱过夜）
5）蛋白封闭过度，封闭时间不要超过10分钟
Q13：染色阴性
1）操作步骤错误重新试验，设立阳性对照2）组织中无抗原设立阳性对照片，以验证实验结果3）一抗与二抗种属连接错误仔细确定一抗与二抗种属无误。